陈佳妍从小家境富裕，16岁考入中央戏剧学院，是班里年龄最小的一个；与陈好、贾一平等是同班同学，从1998年接拍第一部戏起，她就再也不肯拿家里的一分钱 。
1998年，因在陈燕民执导的电视剧《海口日记》中饰演经济警察而
进入演艺圈 。1999年，参演由张进战执导的民国爱情剧《西街女》，在剧中饰演镇长的女儿许晴 。2001年1月，与聂远、黄奕共同出演的古装轻喜剧《上错花轿嫁对郎》播出，在剧中饰演心狠手辣的方小巧 。6月，参演由俞钟执导的现代情感剧《我的兄弟姐妹》，在剧中饰演任性叛逆的小妹齐妙 。2002年12月，与江珊、汤镇宗、钟汉良等共同主演的年代情感剧《千丝万缕》开播，在剧中饰演家庭教师郑思嘉 。2003年，与黄晓明共同主演的青春偶像剧《花妮妹妹》播出，在剧中饰演云南姑娘花妮 ；同年，参演浪漫爱情剧《谁都会说我爱你》。
2004年9月，与吴京安、巍子共同主演的红色革命剧《红旗谱》播出，在其中饰演敢爱敢恨的农村姑娘春兰 。2005年5月，与王亚楠共同主演的抗日剧《野火春风斗古城》播出，在剧中饰演性格刚强、泼辣地下工作者金环 。2006年，与杨童舒、高曙光共同主演励志情感剧《别忘了爱自己》，在剧中饰演精明、大方的陈露 。6月，与侯勇联合主演的警匪片《缉毒警》上映，在片中饰演家庭贫困、为人善良的村民阿花 。
2007年，与刘之冰、王新军共同主演犯罪题材剧《高墙里的男人》，在剧中饰演监区长的妹妹裴晓阳 。2008年9月，由张建栋导演执导的生活情感剧《我们生活的年代》播出，在剧中饰演坚强的叶玉芬 。2010年10月，由黄文利执导的军旅剧《冰是睡着的水》开播，在剧中饰演特工凌兰。2011年3月，与杨立山共同主演的警匪剧《情暖万家》开播，在剧中饰演性格坚强的胡玉莺 。2012年7月，由金琛执导的青春爱情剧《女人帮·妞儿》播出，在剧中饰演女上司Mary。2013年6月，由郭珍霓、谢祖武主演的喜剧片《完美新娘》上映，在片中饰演纹身店的老板雪 。11月，出演的青春爱情剧《女人帮·妞儿第二季》播出，在剧中继续饰演女上司Mary 。2015年12月，由张天爱、盛一伦主演的古装穿越剧《太子妃升职记》播出，在剧中饰演和蔼可亲的太皇太后 。
2016年7月，开始主持网络综艺脱口秀节目《奶奶说》 。2018年5月，由陈正道、许肇任执导的爱情奇幻剧《结爱·千岁大人的初恋》开播，在剧中饰演杂志社主编青檀。6月，与金晨、汪东城共同出演的古装轻喜剧《萌妃驾到》播出，在剧中饰演端庄大气、沉稳老练的太后 。
2004年7月，陈佳妍与演员连奕名相识；8月8日，两人正式确定恋爱关系；12月3日，两人登记结婚，婚后生下一女 。两人于2009年离婚 。
2008年4月，陈佳妍与众多环保志愿者一起带着自己的环保筷进行绿色就餐，呼吁社会大众在就餐时能自带环保筷，商家也能提供消毒碗筷，替代使用一次性餐具 。